[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Konferencja „Nowe metody w neurobiologii” 15 grudnia 2004 21−26
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii
Witold Konopka
Zakład Neurobiologii Molekularnej i Komórkowej, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN
ul.Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Streszczenie
Zwierzęta transgeniczne w ciągu ostatnich 20 lat stały się ważnym narzędziem badawczym w wielu naukach biologicznych
w tym także w neurobiologii. Istnieją cztery główne sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych: 1 - mikroinjekcja
DNA do zygoty, 2 - transfer DNA przy pomocy wirusów, 3 - modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (ang.
Embryonic Stem Cells
), 4 - transplantacja jąder komórkowych. Pierwsze dwie metody wykorzystywane są do otrzymywania
zwierząt głównie z nadekspresją określonych konstrukcji genetycznych. Natomiast technologia ES pozwala na wyłączenie
wybranego genu tzw. „knock-out”. Jak dotąd technikę delecji genów można było zastosować jedynie u myszy. Alternatywną
metodą tworzenia zwierząt typu „knock-out” dla innych gatunków jest technika transplantacji jąder komórkowych.
Obecnie intensywnie rozwijane są metody indukowalnej/warunkowej ekspresji genów. Spowodowane jest to potrzebą uzy-
skania zwierząt, w których ekspresja lub „knock-out” wybranego genu obecne są tylko w określonych komórkach ciała
lub w czasie zależnym od badacza. Głównymi systemami tego typu są: system Cre/lox – umożliwiający „knock-out” genu
ograniczony tylko do pewnego typu komórek oraz system tetracyklinowy – umożliwiający włączanie i wyłączanie ekspresji
wprowadzanego genu w dowolnym czasie.
Wstęp
Sposoby otrzymywania zwierząt
transgenicznych
Pierwsze próby otrzymania transgenicznych myszy
pojawily się już w na początku lat 80-siątych XX wieku
(Gordon i Ruddle 1980, 1981, Costantini i Lacy 1981).
Zwierzęta transgeniczne powstały w wyniku połączenia
dwóch dziedzin naukowych: embriologii doświadczal-
nej oraz biologii molekularnej. Embriologowie opano-
wali umiejętność hodowania zarodków poza ustrojem
oraz rozwinęli techniki manipulacji nimi. Natomiast
w wyniku postępów biologii molekularnej stało się
możliwe niemal dowolne konstruowanie fragmentów
DNA, wprowadzanych następnie do genomu zwierząt
transgenicznych.
Terminem zwierzę transgeniczne określa się takie
zwierzę, które w swoim genomie posiada egzogenny
DNA w postaci:
• losowo zintegrowanego fragmentu liniowego
DNA
• zmodyfikowanego własnego genu w wyniku
wprowadzenia egzogennego DNA (technologia „knock
out” oraz „knock-in”)
• wprowadzonej całej sztucznej jednostki genetycz-
nej np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC
(ang.
Bacterial ArtificialChromosome
) lub sztucznego
chromosomu drożdżowego YAC (ang.
Yeast Artificial
Chromosome
)
Można wyróżnić kilka podstawowych metod wyko-
rzystywanych do transgenizacji zwierząt laboratoryj-
nych oraz hodowlanych:
• mikroinjekcja DNA do zygoty
• transfer DNA przy pomocy wirusów
• modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych
ES (ang.
Embryonic Stem Cells
)
• transplantacja jąder komórkowych
Mikroinjekcja DNA do zygoty
Pierwsza z metod polega na mikroinjekcji DNA
(liniowego lub w postaci sztucznych chromosomów)
do jednego z przedjądrzy jednokomórkowego zarod-
ka – zygoty przy pomocy mikrochirurgicznej szkla-
nej pipety. Przedjądrza posiadają materiał genetyczny
pochodzący od ojca i matki tuż przed połączeniem się
w jedno jądro komórkowe, które pokieruje rozwojem
zarodka w późniejszym okresie. Roztwór DNA wstrzy-
kiwany jest do dowolnie wybranego przedjądrza,
a następnie nastrzyknięte zygoty hodowane są
in vitro
do stadium dwukomórkowego. Brak jest możliwości
dokładnego kontrolowania objętości wstrzykiwanego
roztworu DNA. Mikroinjekcję DNA przeżywa około
50% zarodków, które następnie przeszczepiane są do
22
W. Konopka
jajowodu samic – matek zastępczych. Po okresie cią-
ży trwającej u gryzoni około 3 tygodni rodzi się około
30% przetransferowanych zarodków, wśród których
około 15% posiada w swoim genomie zintegrowany
transgen (Ryc. 1). W metodzie mikroinjekcji integracja
wstrzykniętego transgenu do genomu jest losowa i nie
ma możliwości wyboru miejsca wbudowania. Ponadto
nie można kontrolować liczby kopii transgenu wbudo-
wanych w genom, które często układają się tandemowo.
Otrzymany osobnik transgeniczny może posiadać
transgen we wszystkich komórkach swojego ciała lub
może być chimerą. Chimerą nazywamy taki organizm,
którego komórki ciała nie są identyczne pod względem
genetycznym. W przypadku zwierząt transgenicznych
oznacza to, że niektóre komórki posiadają transgen, na-
tomiast inne nie. Taka sytuacja może się zdarzyć, gdy
integracja transgenu do genomu nastąpiła po pierw-
szym podziale komórkowym i tylko w jednej z komó-
rek potomnych zwanych blastomerami. W przypadku
gdy transgen nie znajduje się w komórkach płciowych
założycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie
będzie on przekazywany następnym pokoleniom, co
uniemożliwi wyprowadzenie linii transgenicznej oraz
przeprowadzenie badań.
Główną zaletą metody mikroinjekcji DNA jest
brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA.
Dokonuje się injekcji DNA pochodzącego z plazmi-
dów (ok. 10 kpz), kosmidów (ok. 45 kpz) a także DNA
sztucznych chromosomów BAC, YAC (długość frag-
mentu DNA siegająca milionów par zasad).
Transfer DNA przy pomocy wirusów
Kolejną metodą wykorzystywaną do otrzymywania
zwierząt transgenicznych jest infekcja przy pomocy
retrowirusów i lentiwirusów. Główną przewagą tej me-
tody nad innymi jest jej wyjątkowo duża wydajność,
sięgająca nawet 80% transgenicznego potomstwa.
Ponadto retrowirusy i lentiwirusy posiadają zdol-
ność integracji do genomu po wniknięciu do komórki.
W przypadku retrowirusów głównym ograniczeniem
stało się wyciszanie ekspresji genów (obecnych w
sekwencji wbudowanego do genomu retrowirusa)
podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej
pozbawione są lentiwirusy, stanowiące jedną z klas
retrowirusów. Lentiwirusy są zdolne do infekcji dzie-
lących się oraz nie dzielących się komórek. Z tego po-
wodu znalazły szerokie zastosowanie jako wektory w
terapiach genowych. Do otrzymania zwierząt transge-
nicznych z zastosowaniem lentiwirusów wykorzystano
dwie metody: infekcje jednokomórkowych zarodków
(Lois i wsp. 2002) oraz infekcje pierwotnych komórek
zarodkowych ES (Pfeifer i wsp. 2002).
Ryc. 1. Transgenizacja przy pomocy mikroinjekcji DNA do przed-
jądrza zygoty.
Modyfikacjapierwotnychkomórek
zarodkowych ES
Metoda otrzymywania zwierząt transgenicznych z
wykorzystaniem pierwotnych komórek zarodkowych
ES (ang.
embryo stem cells
) pozwala na precyzyj-
ną modyfikację badanego genu lub miejsca w geno-
mie (Ryc. 2). Komórki ES izolowane są z blastocysty
(wczesny etap rozwoju zarodka), dzięki czemu otrzy-
muje się komórki niezróżnicowane, które posiadają
zdolność wbudowywania się do tkanek rozwijającego
się zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocy-
sty (Evans i Kaufman, 1981; Martin, 1981).
W metodzie tej komórki ES modyfikowanesą
in vi-
tro
w bardzo precyzyjny sposób. Podstawową techniką
wprowadzania genów do komórek ES jest elektropora-
cja, ale także wykorzystuje się lipofekcję oraz metodę
wapniową. Aby uzyskać pożądane miejsce integracji
wprowadzany fragment DNA zawiera sekwencję genu
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii
23
selekcyjnego otoczoną przez sekwencje homologiczne
do modyfikowanegogenu.Wjądrzekomórkinastępuje
rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana geno-
mowej sekwencji na sekwencję wprowadzaną przez
badacza. Wprowadzenie „obcego DNA” wyłącza pra-
widłowe funkcjonowanie tego genu w komórce, dzięki
czemu uzyskuje się komórkę z wyłączonym genem tzw.
knock-out
. Ekspresja genu selekcyjnego (znajdująca się
na wprowadzonym DNA) pozwala wybrać tylko te ko-
mórki-klony, w których nastąpiła właściwa wymiana
(homologiczna rekombinacja).
Komórkę, w której nastąpiła wymiana i wyłączenie
interesującego nas genu namnaża się w odpowiednich
warunkach selekcyjnych. Komórki potomne następnie
transferuje się do blastocysty, w której zmodyfikowane
komórki ES łączą się z niezmodyfikowanymikomórka-
mi zarodka tworząc jeden organizm. Otrzymana chime-
ra posiada część komórek ze zmienionym genotypem,
czyli z wyłączonym genem –
knock-out
. Jeżeli komórki
ES-
knock-out
zasiedlą tzw. sznury płciowe, czyli ko-
mórki z których w życiu dorosłym powstaną komór-
ki rozrodcze, to taki osobnik będzie mógł przekazać
nową cechę -
knock-out
genu następnemu pokoleniu.
Potomstwo osobników chimerowych jest heterozygo-
tyczne i dopiero po skrzyżowaniu dwóch heterozygot
można otrzymać osobnika homozygotycznego z całko-
wicie wyłączonym genem (knock-out) na obu chromo-
somach homologicznych (Ryc. 2). Opisane wyłączanie
genów stosuje się w celu zbadania funkcji danego genu,
poprzez analizę nieprawidłowości powstałych u homo-
zygotycznych osobników typu
knock-out
.
Transplantacja jąder komórkowych
Wcześniej opisana metoda możliwa jest do zastoso-
wania jedynie u myszy, natomiast dla pozostałych ga-
tunków istnieje inna droga otrzymywania osobników z
wyłączonym genem typu
knock-out
. Wykorzystuje ona
technikę transplantacji jąder komórkowych. Technika
taka określana jako klonowanie somatyczne została
wykorzystana do otrzymania owcy Dolly (Wilmut i
wsp. 1997). W metodzie tej można wykorzystać wie-
le rodzajów komórek somatycznych, które w hodowli
mogą być modyfikowanewpodobnysposóbjakmysie
komórki ES. Po otrzymaniu komórek zmodyfikowa-
nych np. typu
knock-out
, jedną z nich umieszcza się w
pobliżu oocytu, z którego wcześniej mikrochirurgicz-
Ryc. 2. Transgenizacja przy pomocy pierwotnych komórek zarodkowych ES.
24
W. Konopka
nie usunięto jądro komórkowe. Następnie łączy się
obie komórki w procesie elektrofuzji, poddając je dzia-
łaniu pola elektrycznego. W ten sposób otrzymujemy
jednokomórkowy zarodek, którego rozwój kierowany
jest na początku przez składniki zawarte w cytopla-
zmie oocytu, a następnie funkcję rozwoju przejmuje
jądro komórki somatycznej. Jeżeli komórka ta została
wcześniej zmodyfikowananp.poprzez
knock-out
genu,
zmiana ta obecna będzie w każdej komórce powstałego
organizmu.
promotora. Przykłady takich systemów oraz ich wyko-
rzystania w neurobiologii podano poniżej.
System Cre/lox
W systemie tym komórki ES modyfikujesięwcelu
wprowadzenia do badanego genu pewnych sekwencji
bez uszkodzenia funkcjonowania tego genu (tzw. tech-
nologia
knock-in
). W tym przypadku sekwencja bada-
nego genu jest zastępowana przez taką samą sekwencję
otoczoną miejscami loxP. Sekwencje loxP to krótkie se-
kwencje rozpoznawane przez enzym rekombinazę Cre,
który usuwa sekwencję DNA zawartą miedzy nimi. Tak
zmodyfikowanekomórkiESwstrzykujesiędoblasto-
cysty w celu otrzymania myszy ze zmienionym genoty-
pem. Następnie takie myszy (tzn. posiadające gen, któ-
ry chcemy usunąć, otoczony sekwencjami loxP) krzy-
żuje się z myszami posiadającymi gen rekombinazy
Cre. W zależności od własności promotora kierującego
ekspresją Cre, wycięcie genu będzie następowało tylko
w tych komórkach, w których obecny będzie ten en-
zym (Ryc. 3). Przykładem promotora, który wykazuje
specyficznośćdopewnegorodzajukomórek(neuronów
pobudzających przodomózgowia) jest promotor genu α
podjednostki CaMKII. Fragment promotora αCaMKII
(o długości 8,5 kpz) zastosowano do otrzymania myszy
αCaMKII-Cre (Tsien i wsp. 1996a). Otrzymano 14 linii
myszy transgenicznych, które następnie skrzyżowano z
myszami posiadającymi gen β-galaktozydazy pod pro-
motorem β-aktyny, przy czym promotor i gen były roz-
dzielone sekwencją z kodonem „stop” dla transkrypcji.
Sekwencja „stop” była ponadto otoczona miejscami
Systemy warunkowej/indukowalnej
ekspresji genów
W opisanych dotychczas metodach otrzymywania
zwierząt transgenicznych wprowadzone zmiany w ge-
nomie np. nadekspresja lub knock-out wybranego genu,
istnieją od początku życia organizmu i jak w przypadku
zwierząt „knock-out” we wszystkich komórkach ciała.
Czasem może to powodować problemy z interpretacją
wyników tj. u części myszy typu knock-out występu-
ją efekty kompensacji funkcji brakującego genu przez
inne geny homologiczne lub pokrewne. Natomiast w
pewnych przypadkach, gdy badany gen odgrywa klu-
czową rolę podczas rozwoju, jego usunięcie powoduje
obumieranie zarodka, co uniemożliwia prowadzenie
badań. Z tego powodu naukowcy pracują nad systema-
mi warunkowej/indukowalnej ekspresji genów, które
pozwalają na ekspresję bądź „zknockoutowanie” wy-
branego genu tylko w pewnych typach komórek oraz
w czasie zależnym od badacza lub od specyficzności
Ryc. 3. System Cre/lox warunkowej ekspresji genów.
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii
25
loxP, wskutek czego ekspresja β-galaktozydazy moż-
liwa była tylko po usunięciu tej sekwencji rozdziela-
jącej przez rekombinazę Cre. W jednej z linii myszy
obserwowano ekspresję β-galaktozydazy (świadczącej
o zaistniałej rekombinacji Cre-loxP) tylko w komór-
kach pola CA1 hipokampa w mózgu. Opisaną linię my-
szy αCaMKII-Cre skrzyżowano ponadto z myszami
posiadającymi gen dla receptora NMDAR1 otoczony
sekwencjami loxP. Uzyskano w ten sposób myszy z
„knock-outem” receptora NMDA ograniczonym tylko
do niewielkiego regionu mózgu i tylko do pewnych ko-
mórek – pole CA1 hipokampa (Tsien i wsp. 1996b).
brak jest antybiotyku w komórce) związany z promoto-
rem represor blokuje ekspresję regulowanego przez nas
genu. Natomiast po dodaniu doksycykliny zastępowa-
ny jest on przez odwrotny aktywator, który z antybio-
tykiem zyskuje powinowactwo do promotora P
CMV*-1
i włącza ekspresję (Ryc. 4). Za pomocą doksycykliny
możemy dokonywać wyboru czasu włączenia i wyłą-
czenia ekspresji genu. Natomiast od wyboru promoto-
ra kierującego ekspresją represora i aktywatora zależy
to w jakich komórkach lub tkankach system będzie
działał. Przykładem zastosowania systemu tetracykli-
nowego do badania procesów uczenia się i pamięci w
zwierzętach transgenicznych jest praca, w której dzię-
ki indukowalnej nadekspresji inhibitora calcyneuryny
wykazano jej rolę w regulacji tych procesów (Malleret
i wsp. 2001). Otrzymano podwójnie transgeniczne my-
szy, w których gen inhibitora calcyneuryny znajdował
się pod kontrolą promotora tetracyklinowego, nato-
miast odwrotny transaktywator pod kontrolą promotora
αCaMKII. Doksycyklinę podawano w pożywieniu mi-
niumum tydzień przed wykonaniem eksperymentów.
Ekspresję inhibitora wywołaną doksycyklinę obser-
wowano w korze mózgowej, hipokampie, prążkowiu,
opuszkach węchowych, a trakże w móżdżku. Indukcja
ekspresji genu inhibitora była odwracalna, a brak efektu
System tetracyklinowy
Kolejnym systemem pozwalającym na indukowalną
ekspresję genów jest system tetracyklinowy (Gossen i
Bujard, 1992). W systemie tym gen, który chcemy re-
gulować znajduje się pod kontrolą promotora tetracy-
klinowego (P
CMV*-1
) złożonego z minimalnego promo-
tora CMV oraz z sekwencji operatora tetracyklinowego
(TetO). W ulepszonej wersji tego systemu (Rossi i wsp.
1998) wykorzystano represor oraz odwrotny aktywator
tetracyklinowy. Oba białka wiążą się z promotorem te-
tracyklinowym i regulują jego działanie w sposób za-
leżny od doksycykliny. W stanie podstawowym (gdy
Ryc. 4. Tetracyklinowy system indukowalnej ekspresji genów. rtTA – odwrotny transaktywator tetracyklinowy; tTR – transrepresor tetra-
cyklinowy; TetP – promotor tetracyklinowy (P
CMV*-1
); X – regulowany gen; DOX – Doksycyklina.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]